应用间接ELISA检测犬冠状病毒抗体

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目前检测犬冠状病毒(CCV)抗体的方法有蚀斑减数中和试验、微量血清中和试验、ELISA、间接荧光抗体技术(IFA)等［1～3］。中和试验以其敏感、特异、稳定等特点为国内外学者所公认，但中和试验所需时间长，操作复杂，不利于大规模样品的检测及基层单位使用。为此进行了本研究。 

1　材料与方法 

1.1　种毒与细胞　CCV NL-18参考株与CRFK细胞，引自美国，由本室殷震院士惠赠；犬肾(DK)传代细胞，由加拿大多伦多大学Compell博士惠赠；细胞生长液，为含10%新生犊牛血清的MEM培养液，维持液中不含新生犊牛血清，MEM为Sigma公司产品。 

1.2　血清　CCV阳性对照血清，由本室保存，中和抗体效价为1∶500；CCV阴性对照血清，为本室保存的健康犬血清，中和抗体效价低于1∶4；待检犬血清，采自黑龙江、吉林、内蒙等地未注射CCV疫苗的犬。 

1.3　包被抗原的制备　将CCV NL-18株接种于已形成单层的DK细胞，常规培养，待细胞出现病变并脱落后，将病毒培养液以3 000 r/min离心30 min，弃上清。未脱落的细胞用分散液(胰酶-EDTA混合分散液)从培养瓶中消化下来，3 000 r/min离心30 min，弃上清。将上述2 种方法获得的细胞混合物，加入0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(NaHCO31.59 g, Na2CO3 2.93 g/L,pH9.6)，细胞计数后，保存于-20℃冰箱中。阴性抗原采用正常细胞，经消化后按上述同样方法制备。 

1.4　固定条件的筛选　取阳性抗原包被酶联反应板，各反应孔中的包被量相同。选择甲醇、乙醇、10%甲醛、10%乙醇+4%冰醋酸作为固定剂分别加入到反应孔中，加入量为0.05 mL/孔。固定时间选择5 、15、30、60、120 min，以未固定的病毒抗原作为对照。同时，以阴性细胞包被反应板，取上述固定剂固定，固定时间选择30 min，以未固定的阴性细胞作为对照。测定阳性对照血清的间接ELISA结果。 

1.5　阳性血清的判定标准与OD值界限的筛选　利用阳性、阴性抗原包被酶联反应板，选择中和抗体阳性、阴性血清，测定其不同稀释度的间接ELISA结果。 

1.6　间接ELISA术式　将保存的病毒抗原融化，以0.05 mol/L碳酸盐缓冲液稀释，加入到酶联反应板孔内，0.05 mL/孔，吹干，每孔加入0.05 mL的固定液固定。用0.01 mol/L PBS-Tween冲洗3次，每次3 min，犬血清经PBS稀释后，加入到反应孔中，0.05 mL/孔。将反应板置于37℃恒温箱中1 h，按上述方法洗3次。再加入经PBS稀释的HRP-SPA(上海欣生公司产品，工作浓度为1∶40)，0.05 mL/孔，置37℃感作1 h，冲洗3次。加入底物溶液0.1 mL/孔。底物溶液为含50 mL 0.1 mol/L柠檬酸，50 mL 0.2 mol/L Na2HPO4，40 mg邻苯二胺(OPD)和0.015 mL 30%H2O2。常温避光显色30 min后，加入2 mol/L H2SO4，0.05 mL/孔，终止反应。利用酶联反应检测仪(上海产)在492 nm处测量反应孔的光密度(OD)。 

1.7　CCV中和试验　采用固定病毒-稀释血清法。将采集的新鲜犬血液常温下放置1 h，血液充分自凝后，5 000 r/min离心30 min，过滤除菌。将血清2倍系列稀释10个稀释度，分别加入等量固定浓度为100 TCID50的病毒悬液，置37℃感作1 h后，接种于已形成良好CRFK细胞单层的培养板，每孔0.1 mL，每个稀释度加4孔，37℃吸附1 h。每孔再加维持液0.9 mL，置37℃、60%～80%湿度、5%CO2条件下继续培养4 d，以试验孔出现多核巨细胞作为未保护标准，按改进的Reed-Muench法计算血清中和效价，以中和效价不低于1∶4作为CCV抗体阳性的判定标准。 

2　结果 

2.1　包被抗原收获时间　利用不同时间收获的病毒作为抗原分别包被酶反应板，测定标准阳性血清的间接ELISA结果(以OD值表示，见图1)。可以看出，随着收毒时间的延长，测定的OD值逐渐升高。4 d和5 d收获的病毒抗原所测定的OD值最高。本试验在制备包被抗原时将收毒时间确定为4 d。 

图1　抗原收获时间对ELISA结果的影响 

2.2　抗原包被量　当包被的染毒细胞数从1.2×105/孔下降到3.0×104/孔时，阳性血清的OD值只略有下降，但是当抗原包被量从3.0×104/孔下降到3.75×103/孔时，OD值变化较大，从1.5降至0.5(图2)。故本试验将抗原包被量确定为3.0×104/孔。 

图2　包被的染毒细胞数对ELISA结果的影响 

2.3　固定剂与固定时间　固定的阴性抗原测得的OD值低于未固定的阴性抗原。阳性抗原经固定后，测定的OD值高于未固定的阳性抗原。甲醇和甲醛的固定效果优于乙醇和10%乙醇+4%冰醋酸。本试验将甲醇作为固定剂。在固定时间选择中可看出，固定30 min、1 h、2 h对结果无明显影响(见表1)。本试验将30 min作为固定时间。 

2.4　阳性血清的判定标准与OD值界限　利用阳性抗原板测定中和试验阳性血清，20倍稀释时的OD值高于0.3；利用阴性抗原板测定中和试验阳性血清，2～10倍稀释时OD值在0.5～0.2之间，20倍稀释时OD值低于0.2。中和试验阴性血清无论用阳性和阴性抗原板测定，结果均与阳性血清利用阴性抗原板测定的结果相同。据此，以0.2作为OD值的判定界限，20倍稀释的待检血清，若其ELISA检测结果OD值高于0.2，则判定该血清为ELISA抗体阳性血清，否则为阴性血清。 

2.5　间接ELISA与中和试验检测结果的比较　分别利用中和试验和间接ELISA测定35份犬血清的CCV抗体效价(图3)，血清效价以OD值高于0.2时的最高稀释倍数表示。5份中和抗体阴性血清的ELISA效价低于1∶20，30份中和抗体阳性血清的间接ELISA测定结果均为阳性。经统计学处理表明，2种方法的测定结果呈正相关(P＜0.05，r＝0.82)。 

表1　不同条件下固定抗原对ELISA结果的影响OD值 

图3　35份犬血清间接ELISA与中和试验结果比较 

3　讨论 

本试验建立了检测CCV抗体的间接ELISA方法，经初步应用证实，该方法敏感、特异、快速，可以替代中和试验进行大量的血清样品的检测。该方法以SPA作为酶标记的第2抗体，证实SPA能够与犬IgG特异结合，而HRP-SPA已经是商品化试剂，从而省略了以犬IgG免疫其他动物提纯IgG、HRP标记等繁琐步骤，有利于该方法的推广使用［4］。在操作过程中发现，包被抗原的制备、固定条件以及阳性血清的判定标准对试验结果有很大影响。 

3.1　以DK细胞制备包被抗原　本试验所检测的犬主要为军、警犬和宠物犬。这些犬注射过犬用疫苗。而疫苗在生产过程中，不可避免地含有牛血清蛋白及犬细胞、猫细胞中的蛋白质成分。这些成分作为异种抗原能刺激犬体产生相应的抗体。如果利用猫肾传代细胞制备CCV抗原，则犬体内的抗体与细胞成分会发生特异性的抗原-抗体反应，虽然较病毒与相应抗CCV抗体的反应弱，但却成为间接ELISA反应中的非特异性影响因素。单纯地提纯病毒抗原，可以部分地去除细胞成分，但仍不可避免上述反应的发生。选用有病毒增殖的DK细胞作为包被抗原，可以降低非特异性反应的发生。因为犬体对于犬细胞中的蛋白成分可以产生部分免疫耐受，免疫应答反应弱，犬体产生的抗犬细胞蛋白成分的抗体量很低。在实际应用中，适当地提高阳性血清的判定标准，DK细胞与待检样品中的抗犬细胞成分的抗体虽有反应，但不至于影响最终结果的判定。因此，利用本试验方法可以检出免疫犬的抗体水平。 

3.2　收毒时间　CCV接种DK细胞后，病毒增殖并释放，引起细胞病变，部分细胞变圆、脱落。据报道，单层接毒后继续培养24～36 h收获的病毒感染力最强［5］。本试验以不同时间收获的细胞作为包被抗原，对标准阳性血清测定的OD值表明，待细胞完全病变后作为包被抗原效果好。虽然收毒时间延长至4 d，早期成熟并释放的病毒感染力下降，但是其并未丧失与CCV抗体发生特异性反应的能力。收毒时间延长，病变细胞数量增多，与特异抗体的反应能力增强，包被酶联反应板时可以减少抗原的使用量，从而降低反应的非特异性。 

3.3　固定条件　包被的病毒抗原经甲醇固定后，一方面可以降低非特异性反应。利用阴性抗原包被酶联反应板测定阳性对照血清的OD值，固定后的抗原所测定的结果显著低于未固定的抗原所测定的结果。甲醇作为有机溶剂，可以溶解部分脂类及蛋白成分，减少此类物质与血清中的IgG发生非特异性吸附。另一方面，可以提高与阳性血清发生特异反应的能力。CCV隶属于冠状病毒科，是单链正股RNA病毒，病毒蛋白质的合成发生于聚核蛋白体上，核衣壳的装配发生在胞浆的病毒工厂(毒浆)内，并在内质网和高尔基体的囊状膜上出芽成熟，且在此时附加囊膜突起。甲醇作为有机溶剂，可以提高细胞膜的通透性，使抗原位点暴露，增强抗原与抗体的结合能力［6］。试验中还发现，常用固定剂乙醇对CCV的固定效果不及甲醇和甲醛，其原因有待进一步探讨。 

3.4　阳性血清的判定标准与OD值界限　本试验证实，间接ELISA与中和试验检测CCV抗体效价的结果具有相关性，但在中和抗体效价低的样品利用2种方法测得的结果差别较大。部分中和抗体阳性血清呈现较低的ELISA效价，部分中和抗体阴性血清的ELISA效价偏高。这一方面是非特异性反应的原因，同时也与阳性血清的判定标准有关。本试验在确定阳性标准时，选择的对照血清例数少，经统计学处理后的结果与实际标准的误差增加。另外，本试验是利用HRP标记SPA作为第2抗体参与反应，SPA与犬IgG的Fc片段结合力强，而与IgM的结合力尚未确定，中和试验却可以检测出犬感染CCV后早期IgM的变化。在实际检测时，可以适当提高阳性血清的判定标准，这样虽然可能由于阳性标准的提高而造成漏检，但却可以保证该方法的特异性。此外，如果用抗γ-球蛋白的酶标抗体代替HRP-SPA，就有可能检出低水平的抗体和感染初期的抗体［7］。OD值的界限也与间接ELISA的结果有关。以OD值0.2作为阳性界限，20倍稀释的中和抗体阴性血清有可能出现间接ELISA阴性，将0.3作为阳性界限，低效价中和抗体阳性血清又可能出现ELISA阴性，从而造成漏检。确定的标准应在扩大检测数，以及利用CCV人工感染试验查明保护犬免受CCV攻击的最低抗体水平的试验中加以探讨。

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